Características morfológicas de vermes adultos de Schistosoma mansoni Sambon, 1907 recuperados de camundongos alimentados com dieta hiperlípidíca na fase crônica da infecção esquistossomótica. Análise por microscopia de campo claro e confocal

Estudos em animais experimentais evidenciaram associações significativas entre esquistossomose mansoni e hipercolesterolemia. Estudos in vitro e in vivo já demonstraram que o colesterol é essencial para Schistosoma mansoni, embora este não tenha capacidade de sintetizá-lo. A captação é realizada a partir do ambiente (cultivo ou hospedeiro) através do tegumento. O colesterol está envolvido nos mecanismos de evasão do helminto contra a resposta imunológica, além de poder participar na modulação da sinalização celular e reprodução, estimulando os órgãos reprodutores dos helmintos adultos como observado na fase aguda da infecção experimental. Este trabalho tem como objetivo avaliar se o mesmo fenômeno ocorre na fase crônica. Os helmintos foram recuperados de dez camundongos submetidos à dieta hiperlipídica ou padrão (controle) foram corados pelo carmin cloridrico e montados, individualmente, em lâmina histológica com bálsamo do Canadá. A preparação foi analisada por microscopia de campo claro nos seguintes caracteres: tegumento e o sistema reprodutor nos vermes machos (lobos testiculares, vesícula seminal, lobos testiculares supranumerários e canal ginecóforo) e, nas fêmeas (ovário, oótipo, útero, ovo, glândulas vitelínicas e espermateca). Posteriormente, algumas lâminas foram separadas para visualização pela microscopia confocal dos órgãos do sistema reprodutores acima descritos. Apesar de ter sido observado uma maior quantidade de espermatozoides, uma maior quantidade de oócitos sendo liberados no grupo da dieta, não houve diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos analisados. Houve um aumento na oogênese como observado na fase aguda. Dessa forma, o colesterol pode estar relacionado com a estimulação na atividade dos órgãos reprodutores dos helmintos adultos na fase crônica da infecção.

Ausência de correlação entre a penetração do cimento AH Plus nos túbulos dentinários e a qualidade do selamento

O presente estudo objetivou testar experimentalmente a existência da possível correlação entre a penetração de cimento nos túbulos dentinários e a qualidade do selamento. Foram utilizados 60 incisivos centrais superiores humanos que formaram um único grupo experimental. Após a eliminação das porções coronárias, as raízes foram padronizadas em 13 mm de comprimento. A instrumentação dos canais foi realizada no sentido coroa-ápice, e o comprimento de trabalho estabelecido a 1 mm aquém do forame apical. Como solução irrigadora foi empregado o NaOCl a 5,25% e ao final, EDTA a 17%. Em seguida, todos os canais foram obturados com guta-percha e cimento AH Plus marcado com um corante fluorescente. Para determinar a qualidade do selamento das obturações endodônticas, as amostras foram submetidas ao modelo de infiltração de glicose sob pressão. As raízes foram montadas em um dispositivo de dupla-câmara selada para permitir a infiltração da glicose. Como controle negativo foram utilizados 4 dentes hígidos, e como controle positivo, 2 dentes instrumentados porém, não obturados. Foram utilizados 0,75 mL de solução de glicose a 1 mol/L na câmara superior e 0,75 mL de água deionizada na câmara inferior. Os dispositivos foram conectados a um sistema de distribuição de pressão desenvolvido com o objetivo de permitir a infiltração de 32 amostras em uma mesma etapa. A solução de glicose foi forçada apicalmente sob uma pressão de 15 psi durante 1 hora. Uma alíquota de 50 L foi coletada da câmara inferior para quantificar a glicose infiltrada. A concentração de glicose foi determinada através de um método enzimático com o auxílio do Kit Glucose HK e de um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 340 nm. Na sequência, as amostras foram desacopladas dos corpos de prova, embutidas em resina epóxi e cortadas em 3 secções transversais. Uma sequência de preparação metalográfica padrão foi realizada para permitir a observação da penetração de cimento nos túbulos dentinários por meio de microscopia confocal e óptica. Os dados obtidos nos 2 experimentos foram cruzados pelo teste de correlação de Spearman, o qual revelou a inexistência de qualquer possibilidade de correlação (r = 0,12). Com base nesses resultados, o presente trabalho concluiu que, dentro das condições experimentais usadas, a quantidade de cimento presente dentro dos túbulos dentinários não teve relação com a qualidade do selamento produzido.

Estudo da virulência, adesão e características fenotípicas de isolados do complexo Sporothrix

A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo.

Relógios biológicos e padrões de alimentação em camundongos normais e com sobrepeso

A saudável interação entre o indivíduo e o meio depende do alinhamento entre a dinâmica fisiológica do primeiro e os periódicos movimentos da natureza. A interação entre tais ritmos por sua vez constitui-se em base e derivação do processo de evolução. O comprometimento de tal alinhamento representa um risco para a sobrevivência das espécies. Neste contexto, os organismos alinham seus ritmos fisiológicos a diferentes ciclos externos. Desta forma, ciclos endógenos são coordenados por relógios biológicos que determinam em nosso organismo, específicos ritmos em fase com a natureza, tais como ritmos circadianos (RC), cujo período aproxima-se de 24 horas. O peso corporal, a ingestão de alimentos e o consumo de energia são processos caracterizados pelo RC e a obesidade está associada a uma dessincronização deste processo. A modulação do RC é resultado da expressão dos clock gens CLOCK e BMAL1 que formam um heterodímero responsável pela transcrição gênica de Per1, Per2, Per3, Cry1 e Cry2. As proteínas codificadas por estes genes, uma vez sintetizadas, formam dímeros (PER-CRY) no citoplasma que, a partir de determinada concentração, retornam ao núcleo, bloqueando a ação do heterodímero CLOCK/BMAL1 na transcrição dos próprios genes, formando assim uma alça de retroalimentação negativa de transcrição e tradução. Estes genes asseguram a periodicidade e são significativamente expressos no núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo. Para estudar esse processo em camundongos normais e hiperalimentados, saciados e em estado de fome, foi utilizado um método de registro do comportamento alimentar baseado no som produzido pela alimentação dos animais, e a correlação destes estados metabólicos com a expressão de CLOCK, BMAL1, Per1, Per2, Per3, bem como das proteínas Cry1 e Cry2 no SCN, por análise de imagens obtidas em microscopia confocal. Camundongos suíços controle em estado de fome (CF) e saciados (CS) foram comparados com animais hiperalimentados com fome (HF) e saciados (HS). Nenhum grupo demonstrou diferença nos conteúdos CLOCK e BMAL1, indicando capacidade potencial para modular os ritmos biológicos. No entanto, as proteínas Per1, Per2, Per3 e Cry1 apresentaram menor expressão no grupo CS, mostrando uma diferença significativa quando comparados com o grupo CF (P<0,05), diferença esta não encontrada na comparação entre os grupos HF e HS. A quantidade de proteína Cry2 não foi diferente na mesma comparação. Os resultados do estudo indicaram que as alterações dos ritmos endógenos e exógenos, refletido pelo comportamento hiperfágico observado em camundongos hiperalimentados, pode ser devido a um defeito no mecanismo de feedback negativo associado ao dímero Cry-Per, que não bloqueia a transcrição de Per1 Per2, Per3 e Cry1 pelo heterodímero CLOCK-BMAL1.

Quantificação das células estreladas ativadas / miofibroblastos e análise da apoptose das células do fígado durante a terapia celular na fibrose hepática em ratos

A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas α-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de α-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de α-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para α-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e α-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de α-SMA por morfometria mostraram que a expressão de α-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram α-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático.

Análise da expressão de laminina durante o transplante de células mononucleares de medula óssea em ratos hepatectomizados

A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea.

O transplante de células mononucleares de medula óssea contribui para o remodelamento da matriz extracelular durante a regeneração do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose.

Estudo da cromatina nos sítios de fixação à matriz nuclear no domínio do gene TP53 e das modificações epigenéticas e no modelo de progressão tumoral mamária 21T

Dentre os diversos tipos de câncer agressivos, o câncer de mama é o mais comum em mulheres. Mutações hereditárias e adquiridas, assim como alterações epigenéticas atuam em sinergia na carcinogênese mamária e na progressão tumoral. A proteína P53 é uma supressora de tumor e possui uma atuação fundamental na integridade genômica. Apesar do vasto conhecimento sobre o controle da P53 a nível de proteína, ainda pouco se sabe sobre o controle transcricional do gene TP53. A série 21T, uma série de 4 linhagens celulares originadas da mama da mesma paciente, representando diferentes estágios de progressão tumoral mamária, é um eficiente modelo para investigação das alterações epigenéticas e suas influências na expressão gênica ao longo da progressão do câncer de mama. Nós analisamos a organização do domínio do gene TP53 através da técnica de arranjo de DNA, em diversas linhagens celulares de câncer de mama e linhagens controle, e realizamos uma tentativa de caracterizar estes elementos de DNA nas linhagens controle não-tumorais HB2 e MCF10A e nas tumorais MCF-7, MDA-MB-231, T47D, através dos marcadores epigenéticos de eucromatina, H4Ac, e heterocromatina, H3K9me3. Ainda analisamos a ligação de proteínas à região associada à matriz nuclear (MAR), denominada MAR 2, e a possível ligação da proteína ligante à matriz nuclear (MARBP), PARP-1, através de ensaios de gel shift (EMSA). Detectamos que na linhagem controle epitelial mamária, HB2, o gene TP53 está posicionado num domínio de DNA relativamente pequeno, aproximadamente 50 kb, delimitado por dois sítios de fixação à matriz nuclear. Interessantemente, esta estrutura de domínio se apresentou radicalmente diferente nas linhagens de câncer de mama estudadas, MCF7, T47D, MDA-MB-231 e BT474, nos quais o tamanho do domínio estudado estava aumentado e a transcrição do TP53 diminuída. Os enriquecimentos com os marcadores epigenéticos de cromatina H4Ac e H3K9me3 estão diferentemente distribuídos nas MARs nas linhagens celulares. Surpreendentemente, a MAR 2 apresentou uma ligação altamente específica, o que poderia representar a atuação de fatores transcricionais envolvidos na organização da cromatina. Através de programas de bioinformática, detectamos putativos sítios para interessantes fatores de transcrição, tais como o c/EBP-beta e c-myb, que poderiam atuar em cis regulando a expressão do gene TP53 e outros flanqueadores. Nós propusemos um modelo para a organização da cromatina na região de domínio do gene TP53 com os genes flanqueadores. Através da série 21T, detectamos uma hipometilação global genômica, nas células cancerosas 21NT e 21MT1. Uma importante diminuição da expressão global do marcador H4Ac nas células metastáticas 21MT1, foi detectada em relação às outras linhagens. Os níveis de RNAm das principais enzimas relacionadas as modificações epigenéticas são consistentes com as observadas hipometilação genômica e hipoacetilação. Através de microscopia confocal, verificamos que o marcador H4Ac está localizado, na maior parte na periferia e o marcador H3K9me3, pericêntrico nos núcleos tumorais. Por fim, verificamos que o promotor P1 do gene TP53 apresenta um estado de cromatina aberta, e a expressão do gene TP53 é similar em todas as células da série 21T.

Características morfológicas de vermes adultos machos e fêmeas de Schistosoma mansoni recuperados de camundongos desnutridos e deficientes em óxido nítrico

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral.

Papel do antioxidante (vitamina C) na modulação da pressão sanguínea em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)

A hipertensão essencial humana, bem como a hipertensão desenvolvida em Ratos Espontaneamente Hipertensos (SHR), são caracterizadas pelo desenvolvimento de Pressão Arterial (PA) elevada na medida em que a idade avança, sem identificação da causa primária. Está bem estabelecido que este modelo animal apresenta estresse oxidativo (EOx) concomitante a hipertensão. O mecanismo pelo qual o antioxidante reduz a pressão não está claro, por essa razão, é necessário avaliar o comportamento destas enzimas envolvidas na homeostase da PA. Ratos Wistar-Kyoto (WKY) e SHR machos receberam ácido ascórbico, 200 mg / kg / dia por sonda orogástrica durante cinco semanas. A PA, a Hipertrofia Ventricular Esquerda (HVE), o Sistema Renina-Angiotensina (SRA), o Peptídeo Natriurético Atrial (ANP) e o EOx foram comparados entre os grupos por pletismografia, estereologia, microscopia confocal de varrimento a laser, microscopia eletrônica de transmissão, western blotting e análise do RT-qPCR. Os SHR tratados com ácido ascórbico reduziram a PA e a HVE. Além disso, as enzimas envolvidas na homeostase da PA, a renina e a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) normalizaram-se, bem como os Receptores tipo 1 de Angiotensina II (AT1). A grande quantidade de grânulos de ANP no grupo SHR foi reduzida pelo tratamento com ácido ascórbico. O balanço oxidativo foi restabelecido nos SHR tratados com este antioxidante. O EOx nos SHR eleva os níveis de renina e de PA. Estas espécies reativas de oxigênio podem ser envolvidas no mecanismo de sinalização para aumentar a expressão de ANP nos miócitos atriais. Estes dados também mostram que o tratamento com o antioxidante (vitamin C) reduz o EOx e normaliza a PA ao menos parcialmente pela redução de taxas de renina.

Efeito antiobesogênico do óleo de peixe: função do tecido adiposo marrom e branco

A modulação do tecido adiposo marrom (TAM) e do tecido adiposo branco (TAB) está associada à prevenção ou redução do ganho de massa corporal. O óleo de peixe possui diversos efeitos benéficos que podem estar relacionados a esses tecidos. Dessa forma, objetivou-se avaliar os efeitos antiobesogênicos de diferentes dietas hiperlipídicas com óleo de peixe na termogênese do TAM e na lipogênese e beta-oxidação do TAB. Para isso, foram utilizados camundongos machos C57BL/6, com três meses de idade, que foram divididos em quatro grupos experimentais: um que recebeu dieta standard-chow (SC, 10% kcal de lipídios) e outros três que receberam dieta hiperlipídica (HL, 50% kcal de lipídios). Obtivemos os grupos HL com banha de porco (HL-B), HL com banha de porco mais óleo de peixe (HL-B+Px) e HL com óleo de peixe (HL-Px). As dietas foram administradas por um período de oito semanas, sendo que a ingestão alimentar foi avaliada diariamente e a massa corporal, semanalmente. Na última semana de experimento, realizou-se a calorimetria indireta e o teste oral de tolerância à glicose. No sacrifício, a glicemia foi aferida, o sangue foi puncionado para obtenção do plasma e o TAM interescapular e o TAB epididimário foram dissecados e armazenados. A leptina, os triglicerídeos e a insulina foram mensurados no plasma. O índice de adiposidade e o HOMA-IR foram calculados. O TAM e o TAB foram avaliados por microscopia confocal e de luz. Realizou-se RT-qPCR e Western blot para avaliação de marcadores termogênicos, da captação e oxidação de ácidos graxos e glicose e de PPAR no TAM, e para a avaliação da lipogênese e beta-oxidação e de PPAR no TAB. Com relação aos resultados, o grupo HL-B apresentou ganho de massa corporal e elevação da adiposidade, associado com hipertrofia dos adipócitos, hiperleptinemia, hipertrigliceridemia, intolerância à glicose e resistência à insulina, reproduzindo um quadro de obesidade e síndrome metabólica. Por outro lado, a ingestão de óleo de peixe nos dois grupos (HL-B+Px e HL-Px) foi capaz de reduzir o ganho de massa corporal e a adiposidade, sem alterar a ingestão alimentar. Essa ingestão também aumentou o gasto energético dos animais, regularizou a leptina e os triglicerídeos plasmáticos, bem como a tolerância à glicose e a resistência à insulina. Esses efeitos foram associados ao aumento de marcadores termogênicos no TAM, bem como da captação e oxidação de ácidos graxos e glicose e da expressão de PPAR nesse tecido. No TAB, houve redução de marcadores da lipogênese e aumento de marcadores da beta-oxidação, juntamente com elevação na expressão de PPAR. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe tem efeitos antiobesogênicos em camundongos através da modulação benéfica do TAM e do TAB e pode, portanto, representar uma terapia auxiliar alternativa contra a obesidade e suas comorbidades.

Formação de biofilmes por Enterococcus faecium sensível e multirresistente aos antimicrobianos: características à proteômica

Enterococcus faecium tem se destacado no cenário das infecções hospitalares, particularmente, amostras portadoras de características de multirresistência. Apesar de serem responsabilizados como agentes etiológicos em diferentes quadros clínicos, fatores associados a patogênese das infecções ainda não estão esclarecidos. Entretanto, sabe-se que a capacidade de formação de biofilmes pode ser responsabilizada como um dos atributos capazes de promover o papel patogênico desses microrganismos. Assim sendo, este estudo se propôs a investigar a capacidade de formação de biofilmes por duas amostras de E. faecium: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (multirresistente e pertencente a um complexo clonal globalmente disperso). As amostras foram caracterizadas fenotipica e genotipicamente para confirmação da identificação, determinação da susceptibilidade a 17 antimicrobianos, caracterização da concentração mínima inibitória para ampicilina, gentamicina e vancomicina, determinação do genótipo vanA e detecção de genes associados a expressão dos genes asa1, cylA, esp, gelE e hyl. A análise quantitativa da formação por 24h e 72h dos biofilmes foi realizada por metodologia do cristal violeta, em placas de microtitulação de poliestireno. Foram construídas curvas de formação pela avaliação da DO570nm das preparações coradas por cristal violeta em períodos de tempo de 2h a 74h. A influência de subCMIs de ampicilina, gentamicina e vancomicina na formação de biofilmes de E. faecium foi também caracterizada em ensaios de quantificação da biomassa. A presença de DNA e proteínas foi avaliada em ensaios de destacamento e por fluorimetria. A arquitetura, distribuição espacial e reação aos fluorocromos Syto9 e SYPRO Ruby Protein foram evidenciadas por microscopia confocal de varredura a laser. Análises proteômicas através da avaliação por SDS-PAGE e por ESI-Q-TOF também foram empregadas para avaliação de biofilmes versus crescimento planctônico. Nossos resultados demonstraram que a amostra CL-6729 apresentou uma maior biomassa nos tempos analisados. Apesar da menor quantidade de biomassa da amostra SS-1274, o perfil da curva de formação foi semelhante a CL-6729. As análises da matriz por ensaios quantitativos e microscopia confocal revelaram que proteína parece ser um importante constituinte para ambas as amostras, entretanto biofilmes formados na presença de da CMI e durante 24h, parecem sofrer alterações na constituição. Os resultados relativos às espectrometrias de massa sugerem que células de biofilmes de E. faecium podem também estar metabolicamente ativas, devido a identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular, similarmente às células planctônicas. No entanto, investigações complementares são necessárias para quantificar as diferenças relacionadas a sua expressão. Foi observado que ambas as amostras independente das variações fenotípicas e genotípicas são capazes de formar biofilmes maduros exibindo constituição e arquitetura similares. Entretanto, nossos resultados sugeriram que cada amostra responde as diferentes situações de acordo com seus determinantes de virulência e resistência.

Regulation of single exocytotic events by the cAMP signaling pathway

Permanece por esclarecer como a via de sinalização do cAMP modula a exocitose regulada. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos eventos exocitóticos, nas propriedades dos poros de fusão e na secreção hormonal; ii) perceber o impacto da sinalização por cAMP-HCN na exocitose e nas propriedades do poro de fusão; e iii) estudar as propriedades do poro de fusão na presença de um agente neurotóxico comum, como o alumínio. Lactotrofos, isolados a partir da hipófise anterior de ratos Wistar machos, foram usados como modelo celular. Os eventos unitários de fusão exocitótica e a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios eletrofisiológicos efectuados segundo a técnica de contacto hermético no modo sobre a célula aderida à pipeta porta-elétrodo e com recurso a métodos imunológicos de deteção. Os níveis intracelulares de cAMP foram aumentados por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina- 3',5'-monofosfato cíclico (dbcAMP). A expressão dos canais HCN foi determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoquímica em combinação com microscopia confocal. Culturas primárias de lactotrofos foram também transfetadas com DNA plasmídico que codifica HCN2 juntamente com a proteína-verde-fluorescente e um agente farmacológico foi usado para avaliar o efeito de cAMP-HCN na exocitose. Observou-se que os lactotrofos responderam à forscolina e ao dbcAMP libertando PRL de um modo bifásico e dependente da concentração, uma vez que a secreção aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e altas concentrações. Os compostos que elevaram os níveis de cAMP aumentaram os eventos transientes e impediram a fusão completa. Além disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitóticos transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fusão, de maior diâmetro, se mativeram abertos durante mais tempo. A expressão das quatro isoformas de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nível do mRNA e, tal como no coração, rim e hipófise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos lactotrofos com sobre-expressão desta isoforma, o dbcAMP não só aumentou a frequência dos eventos transientes e a condutância dos poros, mas também a frequência dos eventos de fusão completa. Enquanto o bloqueador dos canais HCN, ZD7288, reduziu a frequência dos eventos transientes e de fusão completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o diâmetro dos poros de fusão. A simultânea diminuição da libertação de PRL, da frequência dos eventos transientes e do diâmetro dos poros de fusão representaram as principais alterações observados após pré-tratamento dos lactotrofos com concentração micromolar de alumínio. Em conclusão, os resultados demonstram que elevados níveis de cAMP reduzem a secreção de PRL devido à estabilização dos poros de fusão no estado de maior abertura. Além disso, a via de sinalização cAMP-HCN afecta a actividade exocitótica e modifica as propriedades dos poros de fusão, que parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumínio.

Estratégias de alteração da funcionalidade de proteínas de soja

Este trabalho teve como principal objetivo estudar e modificar as propriedades funcionais das proteínas de soja de forma a otimizar e diversificar a sua aplicação industrial. Para tal, foram propostas e estudadas quatro estratégias: i) extração do isolado de proteínas de soja (IPS) a partir de diferentes matérias-primas, ii) adição de galactomananas (GM) com graus de ramificação e massas moleculares diferentes, iii) hidrólise enzimática controlada das proteínas de soja, iv) processamento por alta pressão hidrostática. O estudo e a interpretação da influência destas estratégias sobre as propriedades funcionais das proteínas de soja, nomeadamente, na capacidade gelificante e emulsionante, foram realizados recorrendo fundamentalmente a ensaios reológicos dinâmicos a baixas deformação, espectroscopia de infravermelho, electroforeses, calorimetria diferencial de varrimento e ensaios de microscopia confocal de varrimento laser. O estudo da extração e caracterização dos isolados de proteínas de soja obtidos a partir de diferentes matérias-primas permitiu concluir que as caraterísticas físico-químicas dos isolados são dependentes da origem da matéria-prima de extração e da severidade dos tratamentos industriais prévios à extração do isolado. Contudo, as propriedades viscoelásticas dos géis obtidos por aquecimento controlado não foram significativamente distintas embora tenha sido possível relacionar o grau de agregação com a diminuição da temperatura de gelificação e com o aumento inicial dos módulos viscoelásticos. As alterações sofridas pelos isolados de origem comercial mostraram ser irreversíveis resultando em géis menos rígidos e com maior caráter viscoso. A adição de galactomanana alterou significativamente o mecanismo de gelificação induzido termicamente das proteínas de soja, bem como as propriedades viscoelásticas dos géis e a microestrutura dos géis, demonstrando-se a ocorrência de separação de fases, em virtude da incompatibilidade termodinâmica entre os biopolímeros, resultando em géis mais rígidos e no decréscimo da temperatura de gelificação. A extensão destas alterações foi dependente da massa molecular, grau de ramificação e da razão IPS/GM. O efeito da hidrólise enzimática por ação da bromelina, nas propriedades gelificantes e emulsionantes das proteínas de soja, mostrou ser dependente do grau de hidrólise (GH). Valores de GH inferiores a 15 % melhoraram as propriedades gelificantes das proteínas de soja. Por outro lado, o aumento do GH teve um efeito negativo nas propriedades emulsionantes, o qual foi atenuado por adição da goma de alfarroba, com efeito positivo na gelificação das proteínas de soja. A concentração crítica limite de compatibilidade entre os hidrolisados de proteína de soja e a goma de alfarroba aumentou com o decréscimo do GH e da massa molecular do polissacacrídeo. O efeito da AP sobre as propriedades físico-químicas e funcionais dos IPS foi influenciado pela origem do isolado e pelas condições de tratamento. O processamento até 100 MPa desencadeou um aumento da atividade emulsionante e considerável melhoria da capacidade gelificante. Contudo, valores de pressão superiores promoveram a desnaturação das proteínas constituintes dos isolados, resultando no decréscimo da temperatura de gelificação e numa re-associação das subunidades proteicas, diminuindo a elasticidade dos géis finais. Os resultados sugeriram que as alterações nas proteínas de soja promovidas durante o tratamento por AP constituem um fator limitante para o desdobramento e re-associação durante o aquecimento térmico, necessários para a formação e fortalecimento de gel formado. O processamento por AP influenciou a estrutura secundária e a microestrutura das amostras. A presença de GA teve um papel baroprotetor. Assim, com este trabalho demonstrou-se que com as estratégias seguidas para manipulação das propriedades funcionais de proteínas de soja, nomeadamente através da adição de um polissacarídeo com propriedades estruturais controladas, da adequada combinação da adição de um polissacarídeo neutro com a hidrólise controlada das proteínas ou com tratamento por alta pressão, é possível a criação de novas funcionalidades, com utilidade no desenvolvimento de novas formulações alimentares, permitindo expandir a aplicação destas proteínas vegetais.

Efeito da proteína anticongelante tipo I (AFP I) na criopreservação de embriões e blastómeros de teleósteos

Dissertação de mest., Biologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2007